高鹽廢水是指總含鹽(如Na + 、K + 、Cl - 和SO4^2- 等)質(zhì)量分數(shù)≥1% 的廢水。近年來一些沿海城市積極開展海水的直接利用(如海水用于沖廁、沖洗道路、消防以及工業(yè)冷卻水等),預(yù)計到2020 年,全國海水直接利用量將達到1 × 109 m³ ·a - 1 ,海水直接利用量的快速增長是導(dǎo)致高鹽廢水大量排放的一個重要原因。目前,高鹽廢水較主要的處理方式是通過市政管網(wǎng)進入城市污水處理系統(tǒng)。高鹽廢水通常包含Na + 、K + 、Cl - 和SO4^2-等鹽類物質(zhì),這些離子濃度過高,會快速增大細胞滲透壓從而破壞菌體細胞,同時產(chǎn)生鹽析作用降低脫氫酶活性抑制細菌生長,而且高濃度的氯離子對細菌有一定地毒害作用。因此,高鹽廢水會對傳統(tǒng)污水生物處理工藝產(chǎn)生明顯的抑制作用,特別是在生物處理工藝的啟動期,活性污泥受到抑制會導(dǎo)致工藝出水水質(zhì)惡化,COD 和SS 濃度劇增。生物工藝處理高鹽廢水的較大問題在于微生物的代謝功能遭到破壞,原后生動物數(shù)量劇減,污泥馴化緩慢,反應(yīng)器啟動時間較長。常麗麗等 研究了含鹽廢水生化處理耐鹽污泥馴化,發(fā)現(xiàn)馴化初期城市污水處理廠的污泥對含鹽廢水中COD 的去除率僅為30% ~ 40% ,經(jīng)過80 d 的馴化后COD 去除率才能達到90% 。宋晶等直接馴化嗜鹽菌處理高鹽廢水,采用序批式生物膜法(sequencing batch biofilm reactor, SBBR),通過逐步提高鹽度的方法模擬高鹽廢水的處理,出水COD 能夠達到90% 以上,但嗜鹽菌的馴化與擴培緩慢導(dǎo)致SBBR 很難快速啟動。HAMODA 等 研究發(fā)現(xiàn)高鹽環(huán)境并未完全抑制微生物生長,相反會促進一些嗜鹽細菌的生長;KARGI等發(fā)現(xiàn)通過投加嗜鹽微生物能夠加速微生物群落結(jié)構(gòu)的演替,從而縮短污泥馴化的過程。通過投加復(fù)合菌劑進行生物強化成為了高鹽廢水處理研究的熱點。張波等制備復(fù)合嗜鹽菌劑強化處理高鹽有機廢水,中試實驗結(jié)果表明,投加復(fù)合嗜鹽菌劑能夠加快厭氧反應(yīng)器的啟動,在70 d 內(nèi)就完成了啟動過程,且復(fù)合菌劑能夠有效改善生化系統(tǒng)對TOC 的去除效果,對TOC 的去除率由投菌前的50% 左右提高至70% 以上。大多數(shù)研究僅通過污染物去除效率來描述生物強化的效果,復(fù)合菌劑對活性污泥微生物群落機構(gòu)演替的作用以及其能否在反應(yīng)器中長期存留,均需要進一步研究與探討。

　　本研究依靠投加外源耐鹽高效復(fù)合菌劑,改善生物處理工藝啟動期處理效果,實現(xiàn)高鹽廢水生物處理工藝的快速啟動。采用分子生物學(xué)的方法分析啟動與完成階段活性污泥生物群落結(jié)構(gòu)的變化,考察耐鹽高效復(fù)合菌劑在反應(yīng)體系內(nèi)的存留時間,為開發(fā)高鹽廢水生物處理工藝提供技術(shù)支持。

　　1 實驗部分

　　1. 1 耐鹽高效菌與復(fù)合菌劑制備

　　耐鹽高效菌:本研究采用的耐鹽菌是由本實驗室篩選獲得的耐鹽高效菌O1 和Y5 ;地衣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) O1 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Y5 均可降解高鹽廢水中的有機物,具有耐鹽、適用pH 值范圍寬、適用溫度范圍寬的特點。

　　LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 50 g,Milli-Q 水1 000 mL;LB 固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 50 g,瓊脂15 g,Milli-Q 水1 000 mL;在LB 液體和固體培養(yǎng)基中分別加入45 g 和65 g的NaCl,配置含鹽量5% 和7% 的高鹽LB 培養(yǎng)基,用于復(fù)合菌劑的制備與擴培。

　　親水性聚氨酯生物填料:密度約為23 kg·m - 3 ,孔徑為2 ~ 3 mm,孔隙率> 90% ,比表面積23. 3 × 103m2 ·kg - 1 ,微生物負載量16 ~ 20 kg·m - 3 。

　　復(fù)合菌劑的制備:將已經(jīng)篩選獲得的耐鹽高效菌O1 和Y5 分別接種到鹽度為5% 和7% 的LB 液體培養(yǎng)基中,在25 ℃ 、150 r·min - 1 的條件下培養(yǎng),每隔2 h 測定OD600 ,當菌株Y1 和Q5 的OD600 值分別達到3. 10 和1. 39 時,由畫線法可測得LB 液體培養(yǎng)基中的菌濃度達到107 CFU·mL - 1 。將分別含有2 株菌的LB 液體培養(yǎng)基按1∶ 1 體積比混合 ,離心并撇除上清液,加入PBS 緩沖液沖洗3 次,其菌含量約為1 gMLVSS·L - 1 。

　　復(fù)合菌劑的負載:將分別含有2 株菌的LB 液體培養(yǎng)基按1∶ 1 體積比混合,同時加入邊長為1 cm 的聚氨酯立方體1 g,在25 ℃ ,150 r·min - 1 的條件下培養(yǎng)12 h 即完成了復(fù)合菌劑的固定化,取出聚氨酯立方體,用PBS 緩沖液沖洗3 次,其負載量約為0. 8 g MLVSS·g - 1 。

　　1. 2 實驗裝置及運行

　　實驗采用的SBR 裝置(見圖1)呈圓柱體,由有機玻璃制成,有效高度為70 cm,內(nèi)徑為19 cm,有效容積為5 L;反應(yīng)器底部設(shè)有微孔砂盤曝氣器,曝氣量由轉(zhuǎn)子流量計調(diào)節(jié);反應(yīng)器上方設(shè)有攪拌器;反應(yīng)器進水、出水、曝氣及攪拌均通過時控開關(guān)自動完成,而排泥則通過手動完成。

　　3 個平行運行的SBR 中R1 和R2 作為實驗組,分別投加復(fù)合菌劑和負載復(fù)合菌劑的填料進行生物強化,R3 作為對照組只保持相同生物量的活性污泥。3 個SBR 的水力停留時間(HRT)均為12 h,排水比為1 /2,其中每個循環(huán)6 h,包括進水0. 5 h,缺氧反應(yīng)1 h,好氧反應(yīng)3 h,排水0. 5 h 以及閑置0. 5 h。污泥濃度(MLSS)控制在3 500 ~ 5 500 mg·L - 1 ,好氧反應(yīng)末端溶解氧(DO)控制在6 ~ 8 mg·L - 1 ,溫度為25 ~ 28 ℃ 。

　　1. 3 接種污泥與實驗用水

　　實驗所用活性污泥取自市政污水處理廠的二沉池。實驗用水取自生態(tài)環(huán)境研究中心家屬區(qū)生活污水,投加粗鹽配成鹽度為3% ~ 5% 的高鹽生活污水,原生活污水常規(guī)水質(zhì)指標見表1。

　　1. 4 DNA 提取及群落結(jié)構(gòu)分析

　　DNA 提取與PCR 擴增:4 mL 污泥樣品10 000 r·min - 1 離心10 min。使用Fast DNA SPIN for Soil 試劑盒(MP Biomedical, France)按提取說明操作。提取的DNA 在Nanodrop 分光光度計(Nanodrop, USA)上測定DNA 的濃度和質(zhì)量,并使用1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA 的完整性。采用PCR 對16S rRNA 的V4 區(qū)進行擴增,引物為515F(5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’),反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性2 min;之后95 ℃ 變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸30 s 共循環(huán)25 次;較后72 ℃ 保持5 min。PCR 反應(yīng)體系為20 μL,包括4 μL 5 × FastPfu Buffer、2 μL 2. 5 mmol·L - 1 dNTPs、0. 8μL 上下游引物(5 μmol·L - 1 )、0. 4 μL FastPfu 聚合酶和10 μg DNA 模板。

　　高通量測序與OTU 分類:采用Illumina Miseq 平臺(Illumina, USA)測序分析,測序數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化后,每個樣品含有28577 條有效序列。有效序列采用Ribosomal Database Project (RDP) 分類。Circos 圖采用Circos 軟件(http:/ / mkweb. bcgsc. ca/ tableviewer/ )繪制;主成分分析(PCA)采用Canoco 5. 0 繪制(Microcomputer,USA);熱圖(Heatmap)采用Hemi 1. 0(http:/ / hemi. biocuckoo. org/ )PCA 和熱圖是基于前含量前10 位菌屬繪制。

　　1. 5 水質(zhì)分析項目及方法

　　TOC:element 元素分析儀測定;DO:YSI550A 溶氧儀測定;pH:SartoriusPB-20 pH 計測定;TDS、MLSS、MLVSS:重量法。

　　2 結(jié)果與討論

　　2. 1 復(fù)合菌劑投加量優(yōu)化

　　采用250 mL 搖瓶實驗考察不同復(fù)合菌劑投加量的SBR 對TOC 的降解效果,從而實現(xiàn)復(fù)合菌劑投加量優(yōu)化。培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速為150 r·min - 1 ,25 ℃ ;將活性污泥接種于搖瓶中,接種量為2 040 g MLVSS·L - 1 ;采用批次換水,停留時間8 h。48 h 后出水的TDS 基本穩(wěn)定,按表2 方法投加復(fù)合菌劑,并且停止換水。取樣周期為2 h,連續(xù)采樣24 h。樣品離心并過0. 45 μm 濾膜,測定TOC 值。

　　表2 反應(yīng)器投菌方案

　　由圖2 可知,隨著復(fù)合菌劑投加量的增加,投加復(fù)合菌劑的生物強化系統(tǒng)(bio-augmentation system,BS)的TOC 降解速度逐漸加快,較大降解率也有所增強。投加1% 、5% 、10% 和15% 復(fù)合菌的由于投菌量由10% 增加到15% ,TOC 去除速率與較大去除率均沒有顯著提高,說明投菌量增加到一定程度后,對系統(tǒng)降解速度和降解效果影響變化不大,所以反應(yīng)器運行選擇10% 投菌量。

　　2. 2 復(fù)合菌劑對SBR 啟動的影響

　　反應(yīng)器啟動共分為3 個階段。個階段(1 ~ 15 d),反應(yīng)器中接種城市污水處理廠活性污泥,接種量約為2 000 mg MLVSS·L - 1 ,并采用普通生活污水作為進水,直到3 個SBR 的TOC 去除率均穩(wěn)定達到85% 以上;第二個階段(16 ~ 25 d),采用高鹽生活污水作為進水,進行復(fù)合菌劑與投加,對R1和R2 每隔1 d 各自投加10% × MLVSS 的復(fù)合菌劑和菌填料,共投加5 次;第三個階段(26 ~ 45 d),保持SBR 的正常運行直到R1 和R2 的TOC 去除率再次穩(wěn)定達到85% 以上。

　　從圖3 可以看出,在SBR 處理高鹽生活污水啟 動期,投加復(fù)合菌劑及菌填料對SBR 的TOC 去除率有非常顯著的提高 ,第15 天到25 天,復(fù)合菌劑投加過程中,R1、R2 的TOC 去除率能夠穩(wěn)定在80% 左右,而R3 的TOC 去除率僅僅從25% 提升至40% ;第26 天至45 天,SBR 運行過程中,R3 的TOC去除率并沒有顯著的提高,直到40 d 才出現(xiàn)緩慢提高的趨勢。第35 天以后,R1 和R2 的TOC 去除率均可以穩(wěn)定在85% 左右,可認為SBR 處理高鹽生活污水啟動完成 ,而直到65 d,R3 的TOC 去除率僅為65. 3% 。此外,對比R1 和R2,在第二階段的出水TOC 呈現(xiàn)出一致性,而在第三階段,R2 的運行狀況明顯更加穩(wěn)定,這也說明投加負載菌填料能夠為復(fù)合菌劑提供更加穩(wěn)定的環(huán)境,懸浮填料表面即可觀察到一層褐色黏膜附著,證明微生物開始附著生長,生物膜逐漸形成。SBR 快速啟動過程中MLSS 及MLVSS 的變化規(guī)律如圖4 所示。R1、R2 和R3 的MLSS 及MLVSS 整體均呈現(xiàn)出先下降,后上升的趨勢。這是由于起初活性污泥微生物受到高鹽度的抑制甚至毒害,導(dǎo)致生物量降低,而隨著污泥的馴化,嗜鹽微生物逐漸開始增殖。值得一提的是R2 的MLSS 劇減,可能是由于投入填料后,部分微生物附著在填料上,從而導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)懸浮固體濃度減少。此外,R1、R2 和R3 MLVSS/ MLSS 的值由0. 068 5 分別降低至0. 623、0. 624 和0. 561,有研究證明高鹽廢水下的活性污泥絮體致密、沉降性能好,這可能是鹽在嗜鹽微生物體內(nèi)富集導(dǎo)致的。

　　2. 3 SBR 群落結(jié)構(gòu)分析

　　對SBR 中活性污泥進行了高通量測序用于揭示反應(yīng)器菌群結(jié)構(gòu)演替以及復(fù)合菌劑的存留狀況。群落結(jié)構(gòu)分析的4 組實驗包括配入高鹽廢水前期(R1、R2 和R3 完成接種后在相同條件下運行,樣品編號Rday15),連續(xù)投加復(fù)合菌劑的R1 組(樣品編號R1 day25、R1 day35、R1 day45),連續(xù)投加復(fù)合菌劑的固定化填料的R2 組(樣品編號R2 day25、R2 day35、R2 day45);連續(xù)投加活性污泥的R3 組(樣品編號R3day25、R3 day35、R3 day45)。不同處理組及采樣階段,菌門水平變化如圖5 所示?；钚晕勰辔⑸镏泻枯^多的為變形菌門( Proteobacteri) 和擬桿菌門( Bacteroidetes),其所占比例較高,分別達到40. 45% 、27. 05% 、4. 69% 和4. 22% 。在整個生物處理啟動過程中,高鹽廢水對活性污泥的馴化以及復(fù)合菌劑的投入使活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變?；钚晕勰嘀兄饕⑸锉壤l(fā)生了明顯改變,R1、R2 和R3 中變形菌門所占比例均出現(xiàn)驟增,分別達到56. 24% 、56. 22% 和63. 72% ,擬桿菌門所占比例則分別降低至16. 11% 、19. 40% 和17. 68% 。對于R1 和R2,從運行第10 天至15 天連續(xù)投加了復(fù)合菌劑和負載復(fù)合菌劑的填料,所以R1 和R2 中厚壁菌門所占比例從1. 31% 分別升高至6. 13% 和4. 54% ;對于R3,由于僅投入活性污泥種泥,其中的厚壁菌門所占比例在運行45 d 僅有0. 95% 。這說明地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) O1 和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Y5 所屬的厚壁菌門雖然具有較強的耐鹽性,但不具備競爭優(yōu)勢,通過復(fù)合菌劑投加,可以在活性污泥總富集,并成為優(yōu)勢種屬。

　　4 組實驗的微生物群落結(jié)構(gòu)熱圖和主成分分析是基于各樣品中含量前10 位菌屬共計34 種菌屬(如圖6 和7 所示)。根據(jù)主成分分析的聚類結(jié)果,可以將R1 和R2 的啟動分為3 個階段,這與反應(yīng)器運行的狀況相吻合。階段(1 ~ 15 d),反應(yīng)器中活性污泥還處于適應(yīng)期,進水為普通生活污水,主要以變形菌門中,如不動桿菌屬(Acinetobacter)、布蘭漢氏菌屬(Alkanindiges)、嗜門菌屬(Methylophius)和生絲微菌屬(Hyphomicroblum)等占優(yōu)勢;第二階段(15 ~ 25 d),開始以高鹽廢水為進水,此時鹽度的沖擊負荷使得微生物群落結(jié)構(gòu)反生改變,變形菌門中的微生物豐度進一步增加,并達到較大豐度;第三階段(25 ~ 45 d),經(jīng)過一段時間的運行和馴化,擬桿菌門中,如鳥桿菌屬(Gelidibacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)等逐漸成為優(yōu)勢種屬,而變形菌門中的微生物豐度下降。有趣的是,由于復(fù)合菌劑和菌填料的投加,第二階段芽孢桿菌屬(Bacillus) 的豐度上升,并在之后的運行中逐漸成為優(yōu)勢種屬,而這一階段R1 與R2 對TOC 的去除率也遠高于R3,因此,復(fù)合菌劑的投加對改善生物工藝有機物去除效果,縮短啟動時間具有顯著的效果。

　　3 結(jié)論

　　1)O1 和Y5 兩株菌均具有很強的耐鹽能力,能夠在高鹽環(huán)境下生存,并且通過復(fù)配能夠獲得較高的有機物降解率。投菌量由10% 增加至15% ,達到相同TOC 去除率的時間沒有大幅度縮短,較大去除率也沒有提高,說明投加量增加到一定程度后,對系統(tǒng)降解速度和降解效果影響變化不大。

　　2)實驗組經(jīng)連續(xù)多次投加耐鹽高效菌制備的復(fù)合菌劑的SBR 能夠在30 d 完成快速啟動,并且在啟動過程中,TOC 的去除率都能夠穩(wěn)定保持在80% 左右。此外,通過投加負載復(fù)合菌劑的菌填料進行生物強化,能夠獲得更長的時效行,并且具備更強的抗沖擊負荷的能力?；谳^好的有機污染物出去效果和較強的抗鹽度沖擊能力,本研究制備的復(fù)合菌劑用于改善生物處理工藝啟動期TOC 的去除率,縮短生物處理工藝的啟動時間具有顯著的效果。若能夠進一步與耐鹽硝化菌和耐鹽反硝化菌復(fù)合,制備多種功效的復(fù)合菌劑,在強化TOC 去除的基礎(chǔ)上,強化生物工藝的總氮去除效果,將更具有實際應(yīng)用價值和工程意義。

　　3)實驗結(jié)果表明復(fù)合菌劑的引入導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)菌群競爭優(yōu)勢的變化,使整個系統(tǒng)快速適應(yīng)水質(zhì)變化,處理效率提高,而通過啟動完成后的生物群落結(jié)構(gòu)分析可以看到所投加的耐鹽高效菌O1 和Y5 在活性污泥微生物總量中所占比例由1. 31% 升高至6. 13% ,說明O1 和Y5 能夠在小試SBR 中長期存留,并逐漸成為優(yōu)勢種屬之一。